greek
english
 
 
 
credit εικόνων
path

Προϊόντα - Βιοσυνθετική Ινσουλίνη

path
 

1. Ανασυνδιασμένη ινσουλίνη (recombinant or biosynthetic or genetic engineered insulin):
Η ανασυνδιασμένη ινσουλίνη αντιπροσωπεύει το πρώτο εμπορικό προϊόν της βιοτεχνολογικής βιομηχανίας. Η παραγωγή της είναι το πιο αξιόπιστο παράδειγμα που αποδεικνύει το ότι η πρόοδος – τον περασμένο αιώνα – στα επιστημονικά πεδία της Μοριακής Βιολογίας και Γενετικής Μηχανικής έχει συντελέσει στην θεραπεία του σακχαρώδη διαβήτη. Στον τομέα αυτό, θεμελιώδεις ανακαλύψεις που συνέβαλαν καθοριστικά στην παραγωγή της και έφεραν επανάσταση στην αντιμετώπιση της νόσου θεωρούνται: Τα ένζυμα περιορισμού - οι λιγάσες - η κλωνοποίηση - η τεχνολογία του ανασυνδιασμένου DNA. Έκτοτε έγινε κατανοητός στην επιστημονική κοινότητα ο χειρισμός του DNA δηλαδή πως κόβεται ένα τμήμα, αντιγράφεται ή ενώνεται με ένα άλλο τμήμα του DNA ... περισσότερες πληροφορίες

1.1 Ιστορικά στοιχεία:
1869: O Paul Langerhans, νεαρός φοιτητής ιατρικής του Πανεπιστημίου του  Βερολίνου ανακαλύπτει με την βοήθεια μικροσκοπίου μικρές παγκρεατικές κυτταρικές συσσωρεύσεις, εξ ου και η ονομασία νησίδια του Langerhans.
1889: O Oscar Minkowski  σε συνεργασία με τον Joseph von Mering επιβεβαιώνουν σε πειραματόζωα τον ρόλο του παγκρέατος στην ρύθμιση των επιπέδων σακχάρου στο αίμα.
1901: O Eugene Lindsay Opie (Johns Hopkins Hospital) υποστηρίζει ότι ο σακχαρώδης διαβήτης συνδέεται με τα νησίδια του  Langerhans.
1911-1912: O ερευνητής Ernest Lyman Scott (Πανεπιστήμιο του Σικάγου) αποδεικνύει ότι, εκχυλίσματα παγκρέατος σε πειραματόζωα μειώνουν την γλυκόζη στα ούρα.
1921: O Nicolae Paulescu υπήρξε ο πρώτος που προσπάθησε ν’ απομονώσει την ινσουλίνη από το πάγκρεας, την οποία είχε ονομάσει παγκρεϊνη.
1920: O Frederick Banting από το Παν/μιο του Τορόντο απομόνωσε εκχύλισμα από τα κύτταρα του Langerhans και το ονόμασε “isletin” (αργότερα insulin).
1922: Άρχισαν τα πειράματα στους ανθρώπους με την επιτυχή χορήγηση κεκαθαρμένης ινσουλίνης σε νεανικό διαβήτη. Τον Νοέμβριο του 1922, η Eli Lilly ξεκίνησε την παραγωγή κεκαθαρμένης ινσουλίνης.
1951: Σταθμός ορόσημο για την Μοριακή Βιολογία, προσδιορίστηκε από τον καθηγητή Frederick Sanger (Cambridge) η πρωτοταγής δομή της πρώτης πρώτης πρωτεϊνης, της ινσουλίνης.  

1961: παρασκευή του πρώτου ουδέτερου διαλύματος ινσουλίνης
1966: Ο Παναγιώτης Κατσόγιαννης υπό την επίβλεψη του καθηγητή Λεωνίδα Ζέρβα πέτυχε την σύνθεση της ανθρώπινης ινσουλίνης συνδέοντας τις αλυσίδες Α και Β με τις δύο δισουλφιδικές ομάδεs.
1970s: Η Novo Nordisk αρχίζει την παρασκευή ημι συνθετικής ινσουλίνης.
1982: Εως τη δεκαετία του 1980 χρησιμοποιούνταν ινσουλίνη από ζώα (αγγελάδες, χοίροι). Το έτος αυτό παράγεται στην Αμερική από την εταιρεία Eli Lilly η humulin, η πρώτη βιοσυνθετική ανθρώπινη ινσουλίνη με τεχνικές του ανασυνδυασμένου DNA.
1996: Παράγεται το σκεύασμα Lispro, το πρώτο βιοσυνθετικό ανάλογο ταχείας δράσης ινσουλίνης, από την εταιρία Eli Lilly.
2014: Σήμερα ανασυνδιασμένη ινσουλίνη παράγεται σε ενέσιμη εμπορική μορφή σε τέσσερεις Ευρωπαϊκές χώρες (Γαλλία, Ελβετία, Δανία). Επίσης παράγεται στην Ινδία, Κίνα και Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής.
Στην διαχρονική έρευνα σχετικά με την ινσουλίνη, πέντε συνολικά ερευνητές έχουν τιμηθεί με το βραβείο Nobel.

1.2 Δομή - Σύνθεση:
H ινσουλίνη αποτελείται απο δύο πολυπεπτιδικές αλυσίδες - την Α και την Β - μήκους 21 και 30 αμινοξέων, αντίστοιχα. Oι πλευρικές αλυσίδες τριών ζευγαριών κυστεϊνών συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς. Oι δύο απο τους τρεις δισουλφιδικούς δεσμούς συνδέουν μεταξύ τους τις δύο πολυπεπτιδικές αλυσίδες της ινσουλίνης, ενώ ο τρίτος απαντά στην Α αλυσίδα. Oι δισουλφιδικοί δεσμοί σταθεροποιούν τη δομή της ινσουλίνης.

Η βόειος ορμόνη διαφέρει από την ανθρώπινη σε 3 ανιμοξέα, ενώ η αντίστοιχη χοιρινή σε ένα μόνον αμινοξύ. Χαρακτηριστική είναι η τάση σχηματισμού διμερών μορίων σε διάλυμα, ενώ παρουσία ψευδαργύρου σχηματίζονται εξαμερή μόρια. Αποθηκεύεται στα β-κύτταρα του παγκρέατος και στο αίμα εκκρίνεται υπό εξαμερή μορφή, όμως η δραστική της μορφή είναι η μονομερής.   

Το γονίδιο που κωδικοποιεί την ινσουλίνη βρίσκεται στο 11ο χρωμόσωμα του ανθρώπου, στην κορυφή του μικρού βραχίονα. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα συντίθεται σαν πρόδρομο πολυπεπτίδιο, την πρε-προϊνσουλίνη (pre-proinsulin), που αποτελείται από 110 αμινοξέα και περιέχει δύο επιπρόσθετες πεπτιδικές ακολουθίες:
α) Την “pre-” αμινο-τελική ακολουθία, ένα σηματοδοτικό πεπτίδιο 24 αμινοξέων, που συμμετέχει στην έκκριση της ινσουλίνης.
β) Την “pro-” καρβοξυ-τελική ακολουθία, ένα κεντρικό πεπτίδιο 35 αμινοξέων, που συμμετέχει στην σωστή  αναδίπλωση των πρωτεΐνικών αλυσίδων.
Μετά την μετάφραση του mRNA της πρε-προϊνσουλίνης, στο ενδοπλασματικό δίκτυο γίνεται αρχικά ενζυμική απομάκρυνση της “pre-” αμινο-τελικής ακολουθίας. Η εναπομείνασα προϊνσουλίνη αναδιπλώνεται σχηματίζοντας τους 3 δισουλφιδικούς δεσμούς μεταξύ θειούχων ομάδων κυστεϊνών και εν συνεχεία εισέρχεται στην συσκευή Golgi. Εδώ υφίσταται την ενζυμική απομάκρυνση της “pro-” καρβοξυ-τελικής ακολουθίας και η προκύπτουσα ώριμη πλέον ινσουλίνη αποθηκεύεται στα κυστίδια Golgi... μηχανισμός σύνθεσης

1.3 Παραγωγική διαδικασία ανασυνδιασμένης ινσουλίνης:
Η παραγωγή ουσίας ταυτόσημης με την ανθρώπινη, σε καθαρή κρυσταλλική μορφή περιλαμβάνει πολύπλοκα επιμέρους στάδια. Προς τον σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται διάφορα κυτταρικά συστήματα όπως κύτταρα θηλαστικών, εντόμων, βακτήρια, ζυμομύκητες, άλλοι μύκητες κλπ. Σαν υποκατάστατα των δύο πρώτων συστημάτων θεωρούνται τα βακτήρια, όμως οι μύκητες έχουν σήμερα καθιερωθεί σαν τα αποδοτικότερα συστήματα για καλλιέργεια - ζύμωση και παραγωγή ανασυνδιασμένων ευκαρυωτικών πρωτεϊνών σε υψηλή-βιομηχανική κλίμακα (large-scale industrial production of recombinant eukaryotic proteins).

H παραγωγική διαδικασία για λήψη βιοσυντιθέμενης ινσουλίνης σε καθαρή κρυσταλλική μορφή περιλαμβάνει πολύπλοκα επιμέρους στάδια:
α. Δημιουργία του συνθετικού γονιδίου ινσουλίνης.
β. Δημιουργία του ανασυνδιασμένου πλασμιδίου - φορέα του γονιδίου.
γ. Ενσωμάτωση (transformation) των πλασμιδίων που φέρουν το γονίδιο της ινσουλίνης, στα χρωμοσώματα των προς καλλιέργεια μυκήτων.
δ. Επιλογή του ανασυνδιασμένου κυτταρικού στελέχους - κλώνου, που περιέχει τον βέλτιστο αριθμό αντιγράφων του πλασμιδιακού γονιδιακού φορέα.
ε. Πρωτογενής καλλιέργεια των ανασυνδιασμένων στελεχών των μυκήτων σε θρεπτικό υλικό ειδικής σύστασης.
στ. Ολοκληρωμένη ζύμωση των ανασυνδιασμένων μυκήτων σε θρεπτικό υλικό ελεγχόμενης συγκέντρωσης, για την βέλτιστη γονιδιακή έκφραση.
ζ. Συλλογή κυττάρων με συνεχόμενη φυγοκέντρηση.
η. Απομόνωση και καθαρισμός της πρόδρομης ινσουλίνης που εκκρίνεται στο υγρό υλικό της καλλιέργειας και μετατροπή της σε ινσουλίνη (HLPC χρωματογραφία – βιομετατροπή με transpeptidation και deprotection – κρυσταλλοποίηση).
θ. Λήψη τελικού στείρου προϊόντος σε λυόφιλη μορφή, μετά από πολλαπλά στάδια καθαρισμού (συμπεριλαμβάνεται χρωματογραφία υψηλής πίεσης για την απομάκρυνση ιχνών από προσμίξεις).
ι. Ταυτοποίηση της ορμόνης με χρωματογραφία μάζης (μοριακή μάζα: 5807,57).
ια. Έλεγχος καθαρότητος κλπ. σύμφωνα με τις προδιαγραφές της αντίστοιχης μονογραφίας της Ευρωπαϊκής Φαρμακοποιίας VIII.   

1.4 Διάφορα:

  • Στην BReMeL έχουμε έρθει σ' επαφή με δύο εταιρείες των Ηνωμένων Πολιτειών Αμερικής που εμπορεύονται τα κατάλληλα στελέχη των μικροοργανισμών, τα πλασμίδια-γονιδιακοί φορείς και τα απαραίτητα accessory για evaluation της τεχνικής.
  • Αναμενόμενη απόδοση της μεθόδου: ~1.5 gr ανθρώπινης ανασυνδιασμένης ινσουλίνης καθαρότητος 99%, ανά λίτρο υγρού καλλιέργειας, δηλαδή 43.200 IU ή  432 ml διαλύματος ινσουλίνης με συγκέντρωση 100 IU/ml.  
  • Η ισχύουσα Νομοθεσία προβλέπει ότι όλα τα biosimilar φάρμακα αδειοδοτούνται αποκλειστικά από αρμόδια Ευρωπαϊκή υπηρεσία, την ΕΜΕΑ (European Medicines Agency). Κατά συνέπεια, η άδεια κυκλοφορίας ενός φαρμακευτικού ιδιοσκευάσματος με βιοσυνθετική ινσουλίνη δεν χορηγείται από τον ΕΟΦ αλλά από τον Ευρωπαϊκό φορέα. Ο χρόνος έγκρισης ανέρχεται σε 210 ημέρες και η χορηγηθείσα άδεια ισχύει αυτομάτως σε  34 χώρες της Ευρώπης.
  • Μονάδες μέτρησης:
    Empirical Formula (Hill Notation): C257H383N65O77S6
    Σχετική μοριακή μάζα, MW: 5807.57 Da
    1 Διεθνής Μονάδα (International Unit, IU) καθαρής κρυσταλλικής ανθρώπινης ινσουλίνης είναι το βιολογικό ισοδύναμο με 34.7μg ή 0.0347 mg, για την ακρίβεια 1/28.8 mg ινσουλίνης,
    ΑΡΑ:
    1 mg ισοδυναμεί με 28.8 IU
    1 gr ισοδυναμεί με 28.800 IU
    1 ml διαλύματος περιέχει 100 IU ή 3.47 mg
 
 
Η ιστοσελίδα είναι υπό κατασκευή
Copyright © 2014 Bremel
twitter
facebook