Εργαστήριο - Οργάνωση

Σκοπός: Όπως αναφέρομε στο “Σχετικά με μας”, ο σχεδιασμός της BReMeL σε πλήρη λειτουργία θα περιλαμβάνει 3 Τμήματα: Παραγωγή, Έρευνα/Διάγνωση, Εκπαίδευση/ Ενημέρωση.

Δίνουμε προτεραιότητα στην ενεργοποίηση του Τμήματος Παραγωγής και στον Τομέα “Παραγωγής Βιοφαρμάκων”. Αρχικά το εργαστήριο θ’ ασχοληθεί με την πρωτογενή παραγωγή 2 βιοπεπτιδίων σε καθαρή μορφή, της ινσουλίνης και του αντιγόνου HΒsAg - πρώτα σ’ εργαστηριακή και μετέπειτα σε μαζική κλίμακα. Τα δύο βιομόρια έχουν μηδενική δομική και φυσιολογική συγγένεια, όμως η υπάρχουσα βιβλιογραφία συνηγορεί για την δυνατότητα της βιοσυνθετικής παραγωγής αμφοτέρων με εφαρμογή της ίδιας τεχνικής.

Δομή του εργαστηρίου: Η αρχική δομή του εργαστηρίου υπαγορεύεται από δύο παράγοντες: α) Την  μικρής κλίμακας παραγωγική διαδικασία των δύο πεπτιδίων και β) την εφαρμοζόμενη μέθοδο παραγωγής. Κατ’ ουσίαν πρόκειται για το “στήσιμο” τριών εργαστηριακών μονάδων, κατά σειρά λειτουργίας: εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας (Γενετικής Μηχανικής) - εργαστήριο Κυτταρικής Βιολογίας - εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας.

Η παραγωγική διαδικασία ανασυνδιασμένης ινσουλίνης / ανασυνδιασμένου HΒsAg σε καθαρή κρυσταλλική μορφή περιλαμβάνει πολύπλοκα επιμέρους στάδια:

1. Δημιουργία του συνθετικού γονιδίου ινσουλίνης ή HΒsAg.

2. Δημιουργία του ανασυνδιασμένου πλασμιδίου - φορέα του αντίστοιχου γονιδίου.

3. Ενσωμάτωση (transformation) των πλασμιδίων που φέρουν το γονίδιο της ινσουλίνης ή του HΒsAg, στα χρωμοσώματα των προς καλλιέργεια μικροοργανισμών.

4. Επιλογή του ανασυνδιασμένου κυτταρικού στελέχους - κλώνου, που περιέχει τον βέλτιστο αριθμό αντιγράφων του πλασμιδιακού γονιδιακού φορέα.

5. Πρωτογενής καλλιέργεια των ανασυνδιασμένων στελεχών των μικροοργανισμών σε θρεπτικό υλικό ειδικής σύστασης.

6. Ολοκληρωμένη ζύμωση των ανασυνδιασμένων μικροοργανισμών σε θρεπτικό υλικό ελεγχόμενης συγκέντρωσης, για την βέλτιστη γονιδιακή έκφραση.

7. Συλλογή κυττάρων με συνεχόμενη φυγοκέντρηση.

8. Απομόνωση και καθαρισμός της πρόδρομης ινσουλίνης που εκκρίνεται στο υγρό υλικό της καλλιέργειας και μετατροπή της σε ινσουλίνη (HLPC χρωματογραφία – βιομετατροπή με transpeptidation και deprotection – κρυσταλλοποίηση).

9. Λήψη τελικού προϊόντος σε στείρα λυόφιλη μορφή μετά από πολλαπλά στάδια καθαρισμού (συμπεριλαμβάνεται χρωματογραφία υψηλής πίεσης για την απομάκρυνση ιχνών από προσμίξεις).

10. Ταυτοποίηση ινσουλίνης / HBsAg με χρωματογραφία μάζης.

11. Έλεγχος καθαρότητος κλπ. σύμφωνα με τις προδιαγραφές της αντίστοιχης μονογραφίας της Ευρωπαϊκής Φαρμακοποιίας VIII.  

Από τα ανωτέρω 11 στάδια, τα 10 στάδια για την λήψη αμφοτέρων των ουσιών είναι όμοια. Διαφέρουν μόνον στο στάδιο 8, διότι - εν αντιθέση με την προϊνσουλίνη - το αντιγόνο HBsAg είναι μια έντονα υδρόφοβη πρωτεϊνη, με αποτέλεσμα την ανεπαρκή έκκριση στο υγρό της καλλιέργειας και την ανίχνευσή της σε υψηλές ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις.  

Εξοπλισμός: Η διαδικασία παραγωγής ανθρώπινης ανασυνδιασμένης ινσουλίνης εμπερικλείει την εφαρμογή και χρήση εξελιγμένων τεχνολογιών και εξοπλισμού (sophisticated technologies and equipment). Από την Κυτταρική Βιολογία θα εφαρμόσουμε τεχνικές των κυτταροκαλλιεργειών (απλή κυτταρική καλλιέργεια - ζύμωση) και από την Μοριακή Βιολογία την τεχνική του ανασυνδιασμένου DNA. Κατά συνέπεια ανάλογος θα είναι και ο απαιτούμενος εργαστηριακός εξοπλισμός.

Όλοι οι χειρισμοί που αφορούν σε κύτταρα και υλικά - ζύμωση των γενετικά τροποποιημένων μικροοργανισμών - απομόνωση / τροποποίηση του εξωκυτταρικού παραγομένου προϊόντος, λαμβάνουν χώρα σε στείρο περιβάλλον.

Στην φάση της αρχικής λειτουργίας του εργαστηρίου για το “σταντάρισμα” της μεθόδου, χρησιμοποιούνται είτε πολυ-επίπεδες φλάσκες (multi-surface flasks) είτε μεγάλες φλάσκες χωρητικότητος 1-10 lit υπό συνεχή ανάδευση του υγρού καλλιέργειας (large stirrer flasks). Κατά την μετάβαση σε υψηλότερη κλίμακα παραγωγής χρησιμοποιούνται βιο-αντιδραστήρες ποικίλης χωρητικότητος από 10-1000 lit και στην υψηλότερη βιομηχανική κλίμακα περισσότερο και από 20.000 lit... περισσότερα

Ένας ενδεικτικός κατάλογος με τα κυριότερα όργανα-υλικά για τον αρχικό εξοπλισμό του εργαστηρίου της BReMeL περιλαμβάνει ... κατάλογος